Celúla

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 16031 (2022) Citar este artículo

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La cristalización de proteínas en células (ICPC) se ha investigado como una técnica para respaldar el avance de la biología estructural porque no requiere purificación de proteínas y un proceso de cristalización complicado. Sin embargo, solo se han informado algunas estructuras de proteínas porque estos cristales se formaron incidentalmente en células vivas y son de tamaño y calidad insuficientes para el análisis de estructuras. Aquí, hemos desarrollado un método de cristalización de proteínas sin células (CFPC), que implica la cristalización directa de proteínas mediante la síntesis de proteínas sin células. Hemos tenido éxito en la cristalización y determinación de la estructura de cristales de poliedros de tamaño nanométrico (PhC) a una alta resolución de 1,80 Å. Además, los nanocristales se sintetizaron a una escala de reacción de solo 20 μL mediante el método de diálisis, lo que permitió el análisis estructural con una resolución de 1,95 Å. Para demostrar aún más el potencial de CFPC, intentamos determinar la estructura de la proteína A de inclusión cristalina (CipA), cuya estructura aún no se había determinado. Agregamos reactivos químicos como un inhibidor de hermanamiento a la solución de CFPC, lo que nos permitió determinar la estructura de CipA a una resolución de 2,11 Å. Esta tecnología amplía en gran medida el método de determinación de estructuras de alto rendimiento de proteínas inestables, de bajo rendimiento, de fusión y que se unen al sustrato que han sido difíciles de analizar con métodos convencionales.

Las proteínas cristalizadas en células vivas se han reportado con frecuencia en las últimas décadas1,2,3. Dichos cristales proporcionan funciones biológicas como almacenamiento de proteínas, protección, catálisis heterogénea y activación del sistema inmunitario4. Las relaciones entre las funciones y las estructuras de los cristales se han investigado mediante la determinación directa de la estructura de los cristales de tamaño micrométrico cultivados en células vivas desde que se determinó por primera vez en 2007 la estructura de los poliedros, un cristal natural dentro de la célula. Se esperaba ampliamente que la cristalización celular de varias proteínas se desarrollara como una herramienta de biología estructural de próxima generación porque no requiere procedimientos de purificación y detección de cristalización a gran escala para obtener cristales de alta calidad2. En 2013, se determinó la estructura cristalina de la catepsina B de Trypanosoma brucei mediante la cristalización de proteínas en células (ICPC) como primer ejemplo de determinación de la estructura cristalina de una proteína recombinante6. Desde entonces, la ICPC se ha intentado numerosas veces, pero solo se han informado estructuras de unas pocas proteínas4,7,8,9,10,11. Esto se debe a que los cristales a menudo se forman incidentalmente en las células y su tamaño y calidad son insuficientes para el análisis estructural12. Por lo tanto, se deben superar varios problemas técnicos al aplicar este método para el análisis de la estructura de proteínas.

Se han desarrollado varios métodos ICPC, como la detección de alto rendimiento y la optimización de los procesos de cultivo celular, en un esfuerzo por resolver estos problemas13,14,15. Se ha desarrollado una canalización que contiene cristalización de proteínas utilizando células de insecto con clasificación por citometría de flujo15. El grupo de LaBaer construyó un conjunto de vectores de expresión de baculovirus para una expresión paralela a gran escala de proteínas en células de insectos y microcristales14 preparados con éxito. Las células de mamíferos e insectos, actualmente utilizadas para ICPC, continúan representando una limitación significativa como plataformas para producir grandes cantidades de microcristales de alta calidad rápidamente. Aunque se ha hecho otro intento de añadir reactivos químicos utilizados para la cristalización in vitro, no ha supuesto mejoras en la ICPC, posiblemente porque se desconoce la eficacia con la que los reactivos penetran las membranas celulares y sus efectos sobre otras funciones celulares12. Se han utilizado bacterias Bacillus thuringiensis (Bt) para expresar protoxinas cry como recipientes de cristalización para proteínas de carga de forma recombinante, pero no se pudieron determinar las estructuras16,17. Una vez que se haya establecido e integrado un nuevo ICPC con métodos de cristalización in vitro para superar estas preocupaciones sobre el ICPC, se espera que este método se convierta en una tecnología más accesible para el análisis de estructuras.

La síntesis de proteínas sin células (CFPS), una técnica de preparación de proteínas utilizada en biología sintética, es muy eficaz para la detección rápida de la síntesis de proteínas18. Sin embargo, se ha considerado inadecuado para los esfuerzos de biología estructural que requieren grandes cantidades de proteína, como la cristalización19,20,21. Aquí, informamos la aplicación de CFPS a ICPC (Fig. 1). Nos enfocamos en (1) establecer la cristalización de proteínas usando CFPS con reacciones rápidas y a pequeña escala y (2) manipular la cristalización agregando reactivos químicos. El cristal de poliedros (PhC) producido en células de insecto por infección de cypovirus (virus de la polihedrosis citoplasmática, CPV) es uno de los cristales de proteínas intracelulares más estudiados. Obtuvimos PhC de tamaño nanométrico en una reacción de 200 μL en 6 h. Determinamos la estructura de la proteína a alta resolución utilizando una línea de luz estándar actual (BL32XU) en SPring-8, una gran instalación de sincrotrón. El PhC cristalizado en una escala de reacción de 20 μL se analizó con éxito a 1,95 Å.

( a ) Ilustración esquemática de la cristalización de proteínas sin células (CFPC) de monómero de poliedrina (PhM) utilizando el kit de síntesis de proteínas de germen de trigo. (b) Fotografía del tubo después de CFPC. ( c ) Imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC) de PhC_CF. Barra de escala 10 μm. ( d ) Una micrografía electrónica de barrido de PhC_CF. Distribución de tamaño de PhC_CF determinada por la imagen SEM. Barra de escala 1 μm.

La ventaja más importante de CFPC es que se pueden agregar varios reactivos a la mezcla de reacción sin impedir la síntesis de proteínas. La estructura de la proteína de inclusión cristalina A (CipA), un cristal bacteriano dentro de la célula, no había sido reportada previamente22. Como descubrimos que se forman cristales gemelos cuando CipA se expresa en E. coli, aplicamos CFPC a CipA con la adición de inhibidores de cristales gemelos durante el proceso de cristalización y logramos obtener cristales adecuados y determinar la estructura de CipA a una resolución de 2,11 Å. . Por lo tanto, CFPC, un método híbrido de ICPC y cristalización de proteínas in vitro, se puede desarrollar a una escala sorprendentemente pequeña para proporcionar una cristalización rápida sin ningún procedimiento de purificación. CFPC abre un nuevo método para cristalizar proteínas inestables y determinar rápidamente sus estructuras.

CFPS es un método convencional de biología sintética para la determinación estructural de proteínas21. Permite la síntesis de proteínas, como proteínas de membrana y ensamblajes de proteínas, que son difíciles de purificar con células vivas23,24. Realizamos CFPS utilizando extractos de germen de trigo porque se ha identificado que estos extractos tienen la mayor actividad de expresión de proteínas entre los sistemas eucariotas25. La cristalización del monómero de polihedrina (PhM) se realizó utilizando el kit de síntesis de proteína de germen de trigo (kit de expresión WEPRO®7240). La reacción de traducción se llevó a cabo utilizando el método de bicapa. Una mezcla de reacción de 20 μL que contenía 10 μL de WEPRO®7240 y 10 μL de la solución de ARNm se cubrió con 200 μL de solución SUB-AMIX® SGC en un microtubo de 1,5 mL y luego se incubó a 20 °C durante 24 h. Los precipitados blancos se recolectaron después de centrifugar la solución de reacción (Fig. 1b). El precipitado cristalino se observó con un microscopio óptico (Fig. 1c). SDS-PAGE y espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) del precipitado mostraron una banda a 28 kDa y un pico de 28,361 Da, respectivamente (Fig. 1 complementaria). Estos resultados son consistentes con el peso molecular calculado del PhM (28.368 Da). Los cristales preparados a partir de la reacción de CFPC (PhC_CF) tienen la misma morfología cúbica que la de PhC sintetizada en células de insecto (PhC_IC). El tamaño promedio de PhC_CF (580 nm) es aproximadamente una quinta parte del de PhC_IC (2700 nm) según lo determinado por microscopía electrónica de barrido (SEM) (Fig. 1d, Fig. 2 complementaria).

Para aclarar la dependencia del tiempo de la formación de PhC_CF, la reacción de cristalización inducida por CFPC se controló a las 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h y 24 h con SEM. Cuando se expresó PhM a 20 °C, los cristales cúbicos se observaron por primera vez 2 h después del inicio de la reacción de traducción (Fig. 2). Se encontró que los tamaños promedio de los cristales medidos después de 2 h, 4 h, 6 h, 12 h y 24 h eran 340 nm, 400 nm, 400 nm, 470 nm y 580 nm, respectivamente. No se observaron cristales por SEM después de 1,5 h de la reacción. Cuando la expresión de PhM se confirmó mediante SDS-PAGE a las 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2,0 h, 3,0 h y 4,0 h después de la reacción de traducción a 20 °C, se observó una banda correspondiente a PhM después de 1 h, pero la banda no se observó a las 0,5 h (Fig. 3 complementaria). Estos resultados indican que se obtienen cantidades insuficientes de PhM para la cristalización después de 1,5 h.

CFPC dependiente del tiempo de PhC_CF. Imágenes SEM e histogramas de tamaño del PhC_CF purificado después de la traducción a 20 °C durante (a) 2 h, (b) 4 h, (c) 6 h, (d) 12 h y (e) 24 h. ( f ) Tamaño de cristal de PhC_CF purificado a lo largo del tiempo. Barras de error = SD. Barras de escala de 1 μm.

Para evaluar la dependencia de la temperatura de la formación PhC_CF, las reacciones de traducción se realizaron a varias temperaturas. Después de 24 h, los cristales se formaron con tamaños promedio de 330 nm, 390 nm, 450 nm, 580 nm y 1170 nm a 4 °C, 10 °C, 15 °C, 20 °C y 25 °C, respectivamente. (Fig. 3). A 15 °C y 25 °C, se observaron cristales cúbicos, pero se observaron muchos cristales redondos a 4 °C y 10 °C. Aunque se espera que la temperatura de reacción afecte la eficiencia de expresión19, los rendimientos de PhM después de 24 h no difirieron significativamente en el rango de temperatura de 10 a 20 °C, según lo confirmado por SDS-PAGE (Figura 4 complementaria). La SDS-PAGE de la solución de reacción después de CFPC, la solución sobrenadante después de la centrifugación y los cristales purificados para comparar las cantidades de PhM en PhC y que quedan en la solución mostró que aproximadamente el 70–80 % de PhM forman PhC a 10–20 °C. pero los rendimientos fueron menores a 4 y 25 °C (Fig. 4 complementaria). Por lo tanto, se espera que el tamaño y la morfología del cristal se vean afectados por la cantidad de PhM cristalizado y la velocidad de cristalización a diversas temperaturas.

CFPC dependiente de la temperatura de PhC_CF. Imágenes SEM e histogramas de tamaño del PhC_CF purificado después de la traducción a (a) 4 °C, (b) 10 °C, (c) 15 °C, (d) 20 °C y (e) 25 °C durante 24 h . ( f ) Tamaño de cristal de PhC_CF purificado sobre la temperatura. Barras de error = SD. Barras de escala de 1 μm.

Para recopilar datos de difracción de los PhC_CF de tamaño nanométrico, los cristales aislados de la mezcla de reacción se difractaron utilizando el haz de micro-rayos X de la línea de luz BL32XU equipada con cristalografía de rotación de sincrotrón en serie (SS-ROX) en SPring-8 (Fig. 5)26,27. PhC_CF obtenido después de 24 h a 20 °C (PhC_CF20 °C/24h) se refinó con una resolución de 1,80 Å y tiene un grupo espacial (I23) y parámetros de red que son esencialmente idénticos a los de PhC_IC (PDB ID: 5gqm) (Cuadros 1, 2). El valor de la desviación cuadrática media (RMSD) de los átomos de Cα para la estructura de PhC_IC es 0.09 Å (Fig. 4a). La principal diferencia entre PhC_CF20°C/24h y PhC_IC es que PhC_CF20°C/24h no muestra densidad de electrones de nucleótidos trifosfato (NTP) unidos a la interfaz de monómero, que se observan en PhC_IC (Fig. 4b–e). Los valores promedio del factor B por residuos de todos los átomos en PhC_CF20°C/24h muestran un gran valor para His76 debido a la falta de trifosfato de citosina (CTP) que interactúa con His76 en PhC_IC (Fig. 4b, d, Fig. 6 complementaria) . En PhC_IC, los residuos de aminoácidos que rodean al trifosfato de guanina (GTP) y al trifosfato de adenosina (ATP) interactúan con los NTP, pero en PhC_CF20°C/24h, que carece de estas densidades electrónicas, no hay una diferencia significativa en la conformación de la cadena lateral entre PhC_CF20 °C/24h y PhC_IC (Fig. 4b–e). Estos resultados indican que la unión de NTP no es esencial para la cristalización de PhM.

Comparación de la estructura cristalina entre PhC_CF20°C/24h y PhC_IC (PDB ID: 5gqm)28. (a) Estructuras superpuestas de PhC_CF20°C/24h (verde) y PhC_IC (magenta). (b,c) Vistas de primer plano de (b) CTP y (c) sitios de unión de ATP/GTP en PhC_CF20°C/24h, (d,e) Vistas de primer plano de (d) CTP y (e) ATP/ Sitios de unión de GTP en PhC_IC. Los 2|Fo| seleccionados − |Fc| Los mapas de densidad de electrones a 1.0σ se muestran en azul. Los enlaces de hidrógeno se indican con líneas de puntos amarillas.

Los cristales formados con CFPC en diversas condiciones proporcionaron conjuntos de datos adecuados para el análisis estructural (Tablas 1, 2, 3). Las estructuras cristalinas se refinaron con un rango de resolución de 1,80 a 2,50 Å. Los valores RMSD de los átomos de Cα de PhC_IC son inferiores a 0,29 Å, lo que indica que la estructura general de PhC_IC se conserva en PhC_CF. Si bien no se obtuvieron conjuntos de datos para los cristales formados a 20 °C durante 2 h y 4 h, y a 4 °C y 10 °C durante 24 h debido a la menor cantidad de imágenes indexadas, obtuvimos un conjunto de datos para PhC_CF20°C/6h con una resolución de 2,50 Å (Tablas 1, 2, 3). La resolución mejoró cuando se incrementó el tiempo de reacción de 6 a 24 h. Esta mejora en la resolución probablemente se atribuya a un aumento en las imágenes indexadas debido al mayor tamaño del cristal (Fig. 2f). Estos resultados muestran que la reacción CFPC de PhC en condiciones optimizadas produce con éxito nanocristales con calidad suficiente para obtener una estructura de alta resolución en solo 6 h. Este tiempo de reacción se reduce drásticamente con respecto al tiempo de cultivo (> 3 días) necesario para obtener cristales comparables de alta calidad utilizando células de insectos15.

Una de las características más críticas de CFPC es la minimización de la escala de reacción. La reacción se llevó a cabo dializando una mezcla de WEPRO®7240 (5 μL), la solución de ARNm (5 μL) y 10 μL de SUB-AMIX® SGC frente a 1,0 mL de SUB-AMIX® SGC. Después de 24 h a 20 °C, se recolectaron cristales (PhC_CF20μL_20°C/24h). El tamaño promedio de PhC_CF20μL_20°C/24h fue de 610 ± 150 nm, que es esencialmente idéntico al tamaño promedio de PhC_CF20°C/24h (Fig. 7 complementaria). El análisis estructural de PhC_CF20μL_20°C/24h obtenido con una escala de reacción de 20 μL por SS-ROX arrojó un conjunto de datos con una resolución de 1,95 Å, que es comparable a los del PhC obtenido con una escala de 220 μL (Tablas 1, 2, 3 ).

Después de validar con éxito CFPC en la cristalización de PhC, aplicamos este método para superar los desafíos actuales en la determinación de la estructura de CipA, ya que brinda la oportunidad de agregar compuestos químicos durante la cristalización. La proteína de inclusión cristalina A (CipA), una proteína hidrófoba de 104 residuos de aminoácidos, forma espontáneamente agregados cristalinos en Photorhabdus luminescens, una bacteria entomopatógena29. Se postula que su función nativa está involucrada en la simbiosis o patogénesis de los nematodos30. También puede formar una agregación cristalizada en E.coli, que se utiliza como plantilla para construir nanomateriales sólidos. Su estructura aún no ha sido determinada22. Los cristales de CipA formados en E. coli (CipAC_EC) con un tamaño promedio de 410 ± 80 nm se difractaron con una resolución de 2,8 Å utilizando el método SS-ROX en la línea de luz BL32XU de SPring-8 (Fig. 8a,b complementaria, Tablas 4, 5). Sin embargo, no pudimos encontrar una solución de MR cuando usamos el modelo AlphaFold2 (AF2) predicho31. Esto se debe a la gran fracción de gemelos de 0,42 (Tabla 4). A continuación, intentamos determinar la estructura de CipA mediante la reducción de la fracción gemela utilizando CFPC. Cuando se expresó CipA mediante CFPC con el método de diálisis32, apareció un precipitado blanco en la mezcla de la solución después de 24 h (Fig. 8c complementaria). La imagen SEM y el MALDI TOF-MS del precipitado mostraron que el precipitado es el cristal CipA (CipAC_CF) con un tamaño promedio de 3400 ± 880 nm (Figura complementaria 8d, e). Esto es ocho veces más grande que el tamaño de CipAC_EC. Se intentó el análisis estructural de CipAC_CF con datos de una resolución de 1,61 Å obtenidos mediante el método de cuña pequeña en BL32XU de SPring-827. Sin embargo, no se pudo determinar la estructura porque la fracción de gemelos todavía era demasiado alta (0,42), como lo es en E.coli. Para superar el problema de hermanamiento que ocurre en los cristales de alta calidad, reconocemos que el método CFPC permite la adición de reactivos que inhiben el hermanamiento, como etanol, 1,4-dioxano, PEG, dextrano y TEG33,34. Las imágenes SEM muestran que los CipAC_CF cristalizados en presencia de aditivos tienen tamaños ligeramente más grandes o similares y formas similares en relación con CipAC_CF cristalizados en ausencia de aditivos (Fig. 9 complementaria). Esto indica que el método CFPC puede ampliarse para incluir diversas manipulaciones químicas de cristales, así como la adición de compuestos químicos y proteínas a cristales y proteínas durante el proceso de crecimiento de cristales.

Los experimentos de difracción de rayos X de los cristales mostraron que CipAC_CF cristalizado en presencia de 3% v/v de 1,4-dioxano reduce drásticamente la fracción gemela a 0,10, con una resolución de 2,11 Å (Tabla 4, 5). El cristal es tetragonal, con un grupo espacial I4 que tiene parámetros de celda unitaria a = b = 60,1 Å, c = 54,0 Å, α = β = γ = 90° (Tablas 4, 5). La estructura se determinó por el método de reemplazo molecular utilizando el modelo de búsqueda creado por AF231 a través de ColabFold35. La estructura del monómero CipA consta del brazo N-terminal seguido de tres cadenas β β1, β2, β3, hélice α y cadenas β β4 y β5. Excepto por el brazo N-terminal, el dominio globular es un pliegue típico de unión a oligonucleótidos/oligosacáridos (OB) (Fig. 5a). Las estructuras de Met1-Asn3 y Asp12-Val19 en el N-terminal no pudieron determinarse debido a la suerte de la densidad de electrones. En la red cristalina, las cuatro hélices α de cada monómero forman un haz de cuatro hélices alrededor del eje de simetría cuádruple cristalográfico y existen como un tetrámero. Este tetrámero es consistente con los resultados de la predicción de estados oligoméricos de PISA36 y se considera la unidad básica del crecimiento de cristales. En cuanto a las interacciones entre monómeros en el tetrámero, los enlaces de hidrógeno (Nδ/Asn62i–O/Leu59ii, Nδ/Asn62i–O/Leu60ii, Nδ/Asn62i–Oδ/Asn62ii, O/Ala66i–Oζ/Tyr68ii y O/Met104i– Nζ/Lys78ii) se forman entre cada hélice (Fig. 5b). Además, las cadenas β1 y β5 de la molécula vecina forman una nueva hoja β con enlaces de hidrógeno (Nζ/Lys56i–Oδ/Asp34ii, Nδ/Asn98i–Oδ/Asp34ii, N/Val100i–O/Val31ii, O/Val100i– N/Val31ii, N/Ile102i–O/Met29ii, N/Ile102i–N/Met29ii y N/Met104i–O/Ile27ii) y puente salino (Nζ/Lys56i–Oδ/Asp34ii) (Fig. 5b). La interacción entre los bordes de cada tetrámero forma la red cristalina básica y se estabiliza aún más por el brazo N-terminal incrustado de la molécula de monómero vecina en la hendidura creada entre la interfaz tetrámero-tetrámero (N/Asp4i-OδAsp61ii, O/ Asp4i-N/Asn58ii, Oδ/Asp4i-Nδ/Asn58ii, N/His6i-O/Lys56ii, Nε/His6i-O/Met37ii, Oγ/Ser8i-Oζ/Tyr96ii y O/Ser8i-Oζ/Tyr96ii) (Fig. 5c).

Estructura cristalina de CipAC-CF con 1,4-dioxano. La estructura de (a) monómero y (b) tetrámero. (a) El monómero CipA consta del brazo N-terminal seguido de tres cadenas β β1, β2, β3, hélice α y cadenas β β4 y β5. (b) las interacciones entre los monómeros (i, ii, iii y iv) en el tetrámero. (c) Estructura reticular e interacciones entre tetrámeros. Los enlaces de hidrógeno se indican con líneas de puntos negros.

Una búsqueda de estructuras similares en el servidor Dali37 muestra proteínas que contienen dominios de pliegues OB, como se esperaba. Entre ellos, se encontró una subunidad B pentamérica de enterotoxina termolábil tipo IIB (PDB ID: 1QB5) de una bacteria patógena con alta similitud estructural (z-score > 9,0). Si bien la homología de secuencia fue inferior al 10%, la topología de los monómeros de esta proteína y CipA es muy similar, con un valor RMSD de 2,2 Å en átomos de Cα equivalentes. Aunque estas proteínas tienen diferentes estados de oligomerización, cada monómero forma un haz de hélices α alrededor del eje de simetría central, y las cadenas β en los monómeros adyacentes forman láminas β en el borde exterior del complejo (Fig. 10 complementaria).

Hemos logrado determinar estructuras cristalinas de dos tipos de proteínas con alta resolución usando CFPC. Se cree que el ICPC de PhC y CipA está influenciado por el entorno complejo de las células vivas5,22. Sin embargo, una comparación de las estructuras de PhC por ICPC y CFPC sugiere que la encapsulación de NTP en PhC no es esencial para la cristalización. Para la cristalización de CipA, la formación del cristal gemelo por ICPC podría inhibirse mediante la adición de moléculas extrañas en CFPC para obtener cristales utilizados para el análisis estructural. Estos resultados sugieren que no se requieren ambientes celulares estrictos para su cristalización. Por lo tanto, al usar CFPC, pudimos determinar los factores de cristalización en entornos celulares, que eran difíciles de investigar solo con ICPC. La cristalización de proteínas con CFPC indica que existen oportunidades para obtener cristales de proteínas recombinantes porque los aditivos pueden controlar la cristalización, como ocurre con la cristalización in vitro.

Se obtuvieron cristales de proteína con datos de difracción de alta resolución a partir de pequeños volúmenes de reacción y breves marcos de tiempo de CFPC. CFPC de PhC nos permitió obtener la estructura de 2.50 Å para cristales obtenidos solo 6 h después de iniciar la reacción. La ICPC que usa células de insecto requiere tres días para obtener PhC_IC después de la infección por el virus (Tabla 1)15. Esto se debe a que las células de insecto involucran varios procesos celulares en la producción de la proteína objetivo. El sistema de reacción CFPS se dedica a producir la proteína objetivo y los cristales. Además, el CFPC que utiliza extractos celulares permite la formación de cristales independientemente de la escala de reacción. Usando una pequeña copa de diálisis, no solo se puede identificar PhC_CF a una escala de reacción de solo 20 μL, sino que también se obtuvo una estructura con una resolución de 1,95 Å. Por lo tanto, se descubrió que CFPC puede sintetizar eficientemente cristales de proteína de alta calidad aprovechando la escala de reacción más pequeña. Esto proporciona una solución al problema de los bajos rendimientos de cristales de alta calidad producidos por ICPC y muestra un gran potencial para facilitar la detección de cristales, lo que no es factible utilizando métodos informados anteriormente y ICPC.

La estructura cristalina de CipA se determinó a alta resolución agregando reactivos químicos a la mezcla de reacción de CFPC. CipAC_CF forma una estructura multicapa compuesta por los tetrámeros como bloques de construcción (Fig. 5). Entre las capas, el N-terminal Asp4-Ser8 interactúa con otra capa para estabilizar los cristales. El apilamiento en capas de los tetrámeros forma un espacio poroso en la estructura reticular. La región de Asp12-Val19, cuya estructura modelo no se ha determinado debido al desorden, se espera que se ubique en ese espacio poroso.

No se observó densidad electrónica de otras moléculas, incluido el 1,4-dioxano utilizado como aditivo, en la interfaz de CipA. Además del 1,4-dioxano, que se sabe que es un inhibidor de gemelos38, se descubrió que los PEG reducen la fracción de gemelos (Tabla 4). En particular, se observó una reducción significativa por PEG400. Se presume que el efecto es similar al efecto proporcionado por el 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD), en lugar del efecto de volumen de exclusión del PEG con un gran peso molecular33. Por otro lado, CipAC_EC preparado por ICPC proporcionó datos de difracción de alta resolución, pero no se pudo determinar la estructura debido a la alta fracción de maclas (Tabla 4). En E. coli, la falta de moléculas que interactúan, como PEG400, en la superficie de CipA puede conducir a la incorporación de tetrámeros invertidos en la estructura cristalina multicapa de CipA_EC, lo que da como resultado una gran fracción de gemelos (Fig. 8 complementaria). De esta forma, CFPC permite controlar el proceso de cristalización para obtener cristales de proteína de alta calidad mediante la adición de reactivos químicos.

CFPC es útil para investigar los pasos de cristalización en células vivas. Se han utilizado varias proteínas modelo para estudiar el mecanismo ICPC12. Estas proteínas modelo se pueden cristalizar incluso en un entorno intracelular rico en impurezas. Estos estudios sugieren que abundantes proteínas endógenas intracelulares y de orgánulos juegan un papel como precipitantes o agentes de hacinamiento, como los polietilenglicoles. Además, se ha intentado la ICPC añadiendo un reactivo de cristalización, pero no se ha confirmado ningún efecto característico sobre la cristalización12. Dado que las reacciones intracelulares inducidas por ICPC son complejas, sigue siendo un desafío identificar los factores de cristalización comunes para las proteínas modelo. En este estudio, se descubrió que la adición de PEG inhibía la macla y promovía la formación de cristales de alta calidad con un tamaño más grande (Figs. 8, 9 complementarias). Se ha informado que PEG induce la separación de fases líquido-líquido (LLPS) en la reacción de CFPS39. Además, LLPS juega un papel importante durante la cristalización de proteínas in vitro40. Por lo tanto, se infiere que el LLPS es un factor involucrado en la promoción de la cristalización de poliedros y CipA en la solución de CFPC. Se está realizando un estudio detallado de esta propuesta.

Establecimos un método CFPC para obtener rápidamente cristales de proteína en volúmenes de microlitros en unas pocas horas sin procedimientos complicados de purificación y cristalización. Además, utilizando los nanocristales se obtuvieron estructuras de proteínas de alta resolución. Aunque se esperaba que el ICPC se convirtiera en una herramienta importante en el análisis de estructuras cristalinas, quedan desafíos cruciales porque los cristales no se forman en cantidades y calidad adecuadas para proporcionar estructuras de alta resolución. Usamos CFPC para permitir una detección rápida de las condiciones de reacción, como la temperatura, el tiempo y los efectos de los aditivos, y logramos la preparación de cristales de proteínas de alta calidad adecuados para el análisis de estructuras. Estos resultados indican que CFPC probablemente será una herramienta poderosa para el análisis de la estructura cristalina de proteínas inestables o de bajo rendimiento, que actualmente se considera un desafío para cristalizar utilizando métodos de cristalización de proteínas convencionales.

Todos los reactivos se adquirieron de TCI, Wako, Nacalai Tesque, Sigma–Aldrich y Life Technologies y se usaron sin purificación adicional.

Las morfologías de los cristales purificados se confirmaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Después de sustituir PBS con agua Milli-Q, los cristales se secaron y observaron por SEM. Los análisis SEM se realizaron en JCM-6000 Neoscope (JEOL). Los cristales de WTPhC y CipA no se disolvieron en agua Milli-Q5,30.

La expresión y la cristalización de PhM se realizaron utilizando un kit de expresión WEPRO7240 (CellFree Sciences). El gen de la polihedrina se clonó en el vector PEU-E01-MCS (CellFree Sciences) para la expresión de la polihedrina. El plásmido se amplificó en bacterias DH5α y se purificó utilizando el Qiagen Plasmid Midi Kit. La transcripción se realizó en tubos de 1,5 mL según el protocolo del kit de expresión. Después de una incubación de 6 h a 37 °C, se usó ARNm para la traducción. Las reacciones de traducción se llevaron a cabo utilizando el método de bicapa. 20 μL de mezcla de reacción que contenía 10 μL de extracto de germen de trigo WEPRO7240, 10 μL de ARNm preparado, 40 mg/mL de creatina quinasa se superpusieron con 200 μL de solución SUB-AMIX SGC en un microtubo y se incubó a 20 °C durante 24 h. Los cristales se recogieron mediante centrífuga y se lavaron varias veces con PBS. La cristalización dependiente del tiempo y dependiente de la temperatura se realizó por el mismo método excepto por el cambio de tiempo y temperatura.

Antes de la recopilación de datos, los cristales se sumergieron en tampón PBS que contenía 50 % de etilenglicol y luego se recogieron con MicroLoops de doble espesor de 1000 μm (Mitegen), y luego se congelaron en nitrógeno líquido. La difracción de datos de PhC se recopiló a 100 K utilizando la línea de luz de BL32XU en SPring-8 con una longitud de onda de rayos X de 1,00 Å. Toda la recopilación de datos fue automatizada por el sistema ZOO, incluido el cambio de muestra por un robot27. Se empleó el método de cristalografía de rotación de sincrotrón en serie (SS-ROX), que se desarrolló para recopilar datos de difracción de microcristales de manera eficiente26,41. Se utilizó un microhaz de 1,2 μm (vertical) × 1,0 μm (horizontal). Los conjuntos de datos se recopilaron mediante una rotación helicoidal de 0,25° y una traslación de 1 μm por fotograma con una velocidad de fotogramas de 58,824 Hz (~ 2 × 1010 fotones/fotograma). La indexación se realizó utilizando CrystFEL versión 0.6.342 con Dirax43 y Mosflm44. El número de imágenes indexadas para PhC_CF20°C/6h, PhC_CF20°C/12h, PhC_CF20°C/24h, PhC_CF15°C/24h y PhC_CF25°C/24h son 1531, 8754, 12,846, 3834 y 12,376, respectivamente. Las intensidades integradas fueron fusionadas por process_hkl en la suite CrystFEL. Los conjuntos de datos no se obtuvieron para PhC_CF20°C/2h, PhC_CF20°C/4h, PhC_CF4°C/24h y PhC_CF10°C/4h debido a la menor cantidad de imágenes indexadas (1, 235, 0 y 258, respectivamente) (Tabla S1 ). La estructura de PhC_CF20°C/24h se resolvió mediante el refinamiento de cuerpo rígido con phenix.refine45 usando la estructura previamente determinada (PDB ID: 5GQM). El refinamiento de la estructura de la proteína se realizó utilizando phenix.refine y REFMAC5 en la suite CCP445,46. La reconstrucción se completó usando COOT47 basado en sigma-A ponderado 2|Fo| − |Fc| y |Fo| − |Fc| mapas de densidad de electrones. Los modelos se sometieron a análisis de calidad durante las distintas etapas de refinamiento con mapas de omisión y RAMPAGE48.

La expresión y la cristalización de CipA se realizaron con el método de diálisis utilizando un kit de expresión WEPRO7240 (CellFree Sciences). La reacción de transcripción se realizó con lo mismo que PhC_CF. Las reacciones de traducción se llevaron a cabo usando el método de diálisis. La mezcla de reacción que contenía 20 μL de extracto de germen de trigo WEPRO7240 que incluía 40 mg/mL de creatina quinasa, 20 μL de ARNm preparado y 40 μL de solución SUB-AMIX SGC se dializó frente a 2,5 mL de solución SUB-AMIX SGC a 20 °C durante 72 H. En cuanto a la cristalización de CipA con aditivos, la mezcla de reacción que contenía 16 μL de extracto de germen de trigo WEPRO7240 que incluía 40 mg/mL de creatina quinasa, 16 μL de ARNm preparado, 16 μL de aditivo de concentración apropiada y 32 μL de solución SUB-AMIX SGC se dializado frente a 2,5 ml de solución SUB-AMIX SGC incluidos los aditivos a 20 °C durante 72 h. Las concentraciones de aditivos en la mezcla de reacción y la solución de diálisis fueron 3 % v/v, 3 % v/v, 1 % v/v, 1 % v/v, 2 % v/v y 1 % v/v para EtOH. Dioxano, PEG400, PEG3350, PEG8000, Dextrano y TEG, respectivamente. Los cristales se recogieron mediante centrífuga y se lavaron con PBS varias veces.

Antes de la recopilación de datos, los cristales se sumergieron en tampón PBS que contenía 50 % de etilenglicol y luego se cargaron en MicroLoops (Mitegen), y luego se congelaron en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de los CipAC se recopilaron a 100 K utilizando la línea de luz de BL32XU en SPring-8 con una longitud de onda de rayos X de 1,00 Å. Las posiciones de los cristales en un crio-bucle se identificaron mediante un escaneo de trama de baja dosis. Los conjuntos de datos completos se obtuvieron fusionando múltiples conjuntos de datos de cuña pequeña (10 ° cada uno) recopilados de cristales individuales. KAMO49 procesó y fusionó automáticamente los conjuntos de datos recopilados. Cada conjunto de datos se indexó e integró utilizando XDS50. Los conjuntos de datos se sometieron a un agrupamiento jerárquico mediante un coeficiente de correlación de intensidades por pares. Los conjuntos de datos en cada grupo se escalaron y fusionaron utilizando rechazos de valores atípicos implementados en KAMO. Los grupos con el CC1/2 más alto se eligieron para análisis posteriores. El hermanamiento se analizó con phenix.xtriage51. La estructura se resolvió mediante reemplazo molecular con Phaser-MR51 de la suite PHENIX utilizando la estructura predicha por AlphaFold231. La reconstrucción se completó usando COOT47 basado en sigma-A ponderado 2|Fo| − |Fc| y |Fo| − |Fc| mapas de densidad de electrones. Los modelos se sometieron a análisis de calidad durante las distintas etapas de refinamiento con mapas de omisión y RAMPAGE48.

Las coordenadas atómicas de PhC_CF20°C/24h, PhC_CF20mL_20°C/24h y CipAC cristalizado con 1,4-dioxano al 3% se han depositado en el Protein Data Bank con el código 7XHR, 7XWS y 7XHS, respectivamente. Todos los demás datos o fuentes están disponibles de los autores correspondientes a pedido razonable.

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Agradecemos a la División de Análisis y Departamento Técnico de Suzukakedai, División de Análisis de Biomateriales, Instituto de Tecnología de Tokio por apoyarnos con las mediciones correspondientes. Los experimentos de radiación de sincrotrón se realizaron bajo la aprobación de 2019B2561, 2020A2541, 2021A2541 y 2021B2744 en SPring-8. Esta investigación fue financiada parcialmente por el Proyecto de plataforma para apoyar el descubrimiento de fármacos y la investigación en ciencias de la vida (Base para apoyar el descubrimiento de fármacos innovadores y la investigación en ciencias de la vida (BINDS)) de AMED con el número de subvención JP21am0101070 (número de apoyo 1854).

Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Nos. JP19H02830, JP22H00347, y Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Molecular Engines" (JP18H05421) a TU y JP18K05140 a SA, y Adaptable y Seamless Technology Transfer Program a través de Target- I+D impulsada (JPMJTR20U1) de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón a TU Este trabajo fue apoyado por SUNBOR Grant de Suntory Foundation for Life Sciences a MK

Keitaro Yamashita

Dirección actual: MRC Laboratory of Molecular Biology, Francis Crick Avenue, Cambridge, CB2 0QH, Reino Unido

Escuela de Ciencias de la Vida y Tecnología, Instituto de Tecnología de Tokio, Nagatsuta-cho 4259, Midori-ku, Yokohama, 226-8501, Japón

Satoshi Abe, Junko Tanaka, Mariko Kojima, Shuji Kanamaru, Ayako Kobayashi y Takafumi Ueno

Unidad de Instrumentación de Ciencias de la Vida SR, Centro RIKEN/SPring-8, 1-1-1, Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo, 679-5148, Japón

Kunio Hirata y Keitaro Yamashita

Iniciativa Internacional de Fronteras de Investigación (IRFI), Instituto de Tecnología de Tokio, Nagatsuta-cho 4259, Midori-ku, Yokohama, 226-8501, Japón

Takafumi Ueno

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SA y TU diseñó la investigación. SA, JT, MK, SK, KH, KY y AK realizaron los experimentos. SA, JT, MK, SK, KH, KY y TU analizaron los datos y discutieron los resultados. SA, SK y TU escribieron el texto principal del manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Satoshi Abe o Takafumi Ueno.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Abe, S., Tanaka, J., Kojima, M. et al. Cristalización de proteínas sin células para la determinación de la estructura de nanocristales. Informe científico 12, 16031 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19681-9

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Recibido: 29 junio 2022

Aceptado: 01 septiembre 2022

Publicado: 03 octubre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-19681-9

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